Voronezh, Voronezh, Russian Federation
Voronezh, Voronezh, Russian Federation
UDK 632 Вредители растений. Болезни растений. Защита растений
UDK 632.4 Грибные болезни растений
This paper provides an overview of parasitic fungi of the genus Rhytisma found in Russia: Rhytisma acerinum (Pers.) Fr., Rh. punctatum (Pers.) Fr., the substrate for which is various types of maple, Rh. salicinum (Pers.) Fr., parasitizing willows and Rh. andromedae (Pers.) Fr. – on the Andromeda sp. Ascomycetes of this genus are the causative agents of black (tar) leaf spot, which damages the decorative qualities of plants, and at the same time, they can serve as indicators of the ecological situation. Types of rhytisma, for which maple leaves serve as a substrate, are widespread in Voronezh and its environs. The goal of this work was to develop, based on the sequences of these species available in the NCBI database, specific primers for their molecular genetic identification. Primer-Blast software was used to create them, and the specificity of the obtained sequences was checked in silico using the BLAST module on the NCBI website. Among the generated primer sequences, selection was made to match the optimal parameters. The use of molecular genetic analysis with these primers can be used for early diagnosis of pathogens, as well as in other cases of difficulties in the morphological determination of plant pathogen species.
Rhitisma, ascomycota, Acer, Salix, Andromeda
Введение
Представители рода Rhytisma – паразитические аскомицеты класса Leotiomycetes, поражающие листья деревьев и трав. По итогам филогенических исследований было предложено рассматривать семейство Rhytismataceae sensu stricto, включая в него восемь родов: типовой род Rhytisma, а также роды Lophodermina, Placuntium, Xyloma, Densorhytisma, Fanglania, Johnstoniella и Shiqia.
Виды ритисмы проявляются крупными черными стромами на живых листьях с одной или несколькими погруженными апотециальными аскоматами, которые прорываются через внешние слои (название таксона происходит от греч. ρυτίς – «морщина»). На данный момент для рассматриваемого рода предложено множество видов и внутривидовых таксонов, однако только меньшая часть из них утверждены, в остальном вопросы их классификации остаются спорными [1].
На территории России встречаются, как минимум, следующие представители данного рода: Rhytisma acerinum (Pers.) Fr. (ритисма кленовая), Rh. punctatum (Pers.) Fr. (ритисма точечная), Rh. salicinum (Pers.) Fr. (ритисма ивовая), Rh. andromedae (Pers.) Fr. Первые два из них паразитируют на различных представителях клена, третий – на иве, четвертый – на травянистых растениях родов Andromeda (подбел), Kalmia, Lyonia, Pieris [2].
Грибы данного рода являются возбудителями черной пятнистости листьев (смоляной пятнистости, англ. «tar spot»). Заражение проявляется в том, что летом на листьях возникают желтые пятна, которые темнеют, ближе к осени становясь черными, с желтым ободком. Пятна, образуемые на листьях Rh. punctatum, содержат характерные структуры из рассеянных черных точек (в то время как у Rh. acerinum они являются сплошь черными, с выпуклыми лабиринтообразными структурами) [3]. Ритисмы, поражающие ивы и подбел, также проявляются обширными выпуклыми черными пятнами с морщинистой поверхностью. Как и некоторые другие паразиты растений, ритисмы могут служить биологическим индикатором условий среды. Атмосферные примеси, в частности сернистый газ, снижают распространенность данного патогена [4].
В результате проведенного мониторинга в Воронежской области Rh. acerinum и Rh. рunctatum обнаружены на листьях A. platanoides L. [5]. Вид Rh. andromedae в ходе исследования верховых болот таежной зоны Западной Сибири был выявлен листьях на Andromeda polifolia L. [6]. Rh. salicinum найдена на листьях Salix sp., на берегу р. Мульпа в Ботчинском заповеднике в Хабаровском крае [7] а также на территории Ханты-Мансийского Автономного округа – Югры [8].
Цель исследования. Данное исследование было выполнено с целью разработки специфических праймеров для определения выше рассмотренных видов рода Rhytisma. Несмотря на то, что зрелые формы ритисмы имеют специфическую морфологию и довольно легко определяются по визуальным признакам, на ранних и промежуточных стадиях развития данные патогены могут иметь неясное проявление на фоне других видов пятнистости. В таком случае уместно применение молекулярно-генетических методов определения возбудителей, в частности с помощью ПЦР со специфическими праймерами. Данный метод может также понадобиться и при исследовании биоматериала, подвергнутого заморозке, высушиванию и другим методам фиксации, затрудняющим морфологическое определение патогенов.
Материалы и методы. Таксономия и систематика грибов сверялась по базе данных «MycoBank» [9]. Для идентификации грибов разрабатывались праймеры на основе ITS1 и ITS2 (Internal transcribed spacer – внутренние транскрибируемые спейсеры), а также 5,8S, 12S, 18S и 28S рРНК. Последовательности ДНК рассматриваемых возбудителей были взяты из базы данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI – The National Center for Biotechnology Information) [10] (Таблица 1).
Таблица 1. Последовательности нуклеотидов представителей Rhytisma
|
Rhytisma acerinum internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence |
gccggccaga ggtccccaaa ccccggaatc cgtgccgtct gagtaccacg caatcgcgaa aaactttcaa caacggatct cttggttccg gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa ttccgtgaat catcgaatct ttgaacgcac attgcgcccc ctggctttcc agggggcatg cctgttcgag cgtcattaca accctcaagc cccggcttgg tcttgggccc gccatccatg gcccgcctca aaagcagtgg cggccccgtc cggtctcaag cgtagtacta ctcgtcgctt gtcgggctcg ggcggcggcc ggccagcaag cccctcacac accaggttga cctcggatca ggtagggata cccgctg |
|
Rhytisma punctatum isolate WA-1 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence |
gccggcccaa agaccccaac ctcttgaatc tgtgccgtct gagtggaacg caaatcgtga aaaactttca acaacggatc tcttggttct ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attccgtgaa tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc tctggatttc ctgggggcat gcctgttcga gcgtcattac aaccctcaag cgcagcttgg tgttgggcct gccggatacg gctcgcctca aagtcagtgg cggcgccgtc cggtctcaag cgtagtacta ctcgtcgctt ggtgggcctg ggcgggcggc cggccagcaa cccccattta tctcggttga cctcgaatca ggtagggata cccgctg |
Окончание табл. 1
|
Rhytisma andromedae voucher Lantz 438 (UPS) 12S small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence; mitochondrial |
tttgggggat gtatagtact cttatgaggc tagttgtgtt ttgaataaaa gtaaatcgtt ataaaataaa cataacacca actacgttgg ataaaattct agatagaata cttattatga ctattttcta tctatatgtc ttgaccaaat tacgtgccag cagtcgcggc aatacgtaga agactagtgt tattcatctt tactaggttt aaagggtacc tagacggtat tattaagcca cctcttcttt gctagaggta aggcaaatat tttactagag tttaatgtaa gaagggagaa tttagggtgt agagatataa ttcgttgata ctctgaagac tggtaatggc gaaagcaccc ttctatgtaa taactgacgt taagggacga aggcttgggg cgcaaccagg attagatacc ctattagtcc atgcagataa ttatgaatgc catagactag atataattta gtttataaat gaaagtgtaa gcattccacc tcaagagtac tgtggcaacg ctggaactga aatcattaga ccgcttctga gaacagtagt gaagcatgtt atataatccg atagccctcg taaaacctta ccacaacttg aatggtgtcc tcttttcttt agcgaagcaa attcgctttt tcttacttgt tgctcagct ctctggtgcc ctaccccttt gctttgctag ggtaagggca aagaagcgca aggccataca aggtctctct agataagtat gccttgcaag gccagagaga gaggggtctt tgcccctcta gaagcaaacc cctcttcatg gggctttgct tctagagcaa aagaagagat attaaattaa agggatgtta caggtgttgc acggttgtct tcagctaatg tcgtgagatt gtggttagtt ccataaaatt agcgtaaacc ccggctttat tttttaatta ttatgataaa gtagttcgtc tgtatattga taaatgataa cagggaaaag ac |
|
Rhytisma salicinum voucher BPI843549 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence |
cattaaagaa ttggtgatgc tctgcgtccc attctcaccc tatgtttatt aaacctcagt tgctttggcc gtcatacagc cggccaaagg accctgaact cttgaattat tgctgtctga gtatatataa caatcgttaa aactttcaac aacggatctc ttggttctgg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgccctc tggtattccg gggggcatgc ctgttcgagc gtcattacaa ccctcaagca acgcttgatg ttaggcctgc cttgattggc gcgccctaaa agaagtggcg gctccgtcca gtctcaagcg tagtaatact cgccacttgt taggcttggg cgagagcttg ccagagaacc cccaatatat atatatatat acacaaggtt gac |
Специфические праймеры разрабатывались на основе данных последовательностей при помощи программного обеспечения Primer-Blast [11]. Специфичность разработанных последовательностей праймеров проверялась in silico посредством модуля BLAST [12] на сайте NCBI.
Результаты и обсуждение. Подобранные праймеры представлены в таблице 2. Среди сгенерированных праймеров были отобраны максимально удовлетворяющие следующим требованиям: отсутствие повторяющихся элементов и палиндромов, оптимальная длина в диапазоне от 16–25 нуклеотидов, соотношение количества AT и GC нуклеотидов около 1:1; низкое значение самокоплементарности полученных праймеров [13].
Таблица 2. Характеристики разработанных праймеров к представителям рода Rhytisma (Tm –температура плавления праймеров, °С; GC % – содержание GC-оснований, %)
|
Праймер |
Последовательность (5'->3') |
Tm |
GC% |
Само-комплемен-тар-ность |
Само-комплементарность 3' |
Длина продукта, п.н. |
|
Rh. acerinum |
||||||
|
Прямой |
CCGTCTGAGTACCACGCAAT |
60.11 |
55.00 |
4.00 |
2.00 |
292 |
|
Обратный |
CCCGACAAGCGACGAGTAG |
60.23 |
63.16 |
3.00 |
2.00 |
|
|
Rh. punctatum |
||||||
|
Прямой |
AATCTGTGCCGTCTGAGTGG |
60.04 |
55.00 |
4.00 |
3.00 |
92 |
|
Обратный |
GCATTTCGCTGCGTTCTTCA |
60.11 |
50.00 |
4.00 |
5.00 |
|
|
Rh. andromedae |
||||||
|
Прямой |
TGACGTTAAGGGACGAAGGC |
60.04 |
55.00 |
4.00 |
2.00 |
508 |
|
Обратный |
GAAGACAACCGTGCAACACC |
59.97 |
55.00 |
4.00 |
1.00 |
|
|
Rh. salicinum |
||||||
|
Прямой |
TACAACCCTCAAGCAACGCT |
59.89 |
50,00 |
3.00 |
3.00 |
120 |
|
Обратный |
TCTCGCCCAAGCCTAACAAG |
60.04 |
55,00 |
3.00 |
3.00 |
|
Заключение
Полученные последовательности праймеров можно использовать для видовой диагностики возбудителей листовых пятнистей растений. В дальнейшем будет проверена эффективность и проведена апробация сконструированных последовательностей на растительном материале с симптомами болезни и без них.
Исследование выполнено в рамках работы по выполнению государственного задания № 5-З23 «Молекулярно-генетическая идентификация фитопатогенов сеянцев (саженцев) основных лесообразующих пород».
1. Phylogeny and taxonomy of Rhytisma-like species worldwide / Q. T. Wang, M. J. Guo, Lv, T., H. S. Zhou, Wang, S. J. Wang, C. L. Hou // Fungal Diversity. – 2023. – Pp. 1-43.
2. Minter, D. W. Rhytisma andromedae. [Descriptions of Fungi and Bacteria] // Descriptions of Fungi and Bacteria. – 1996. – No. 130. – P. 1295
3. Woo, J. Y. The life history and cytology of Rhytisma punctatum on bigleaf maple / J. Y. Woo, A. D. Partridge // Mycologia. – 1969. – Vol. 61. – No. 6. – P. 1085-1095.
4. Bevan, R. J. Rhytisma acerinum as a biological indicator of pollution / R. J. Bevan, G. N. Greenhalgh // Environmental Pollution. – 1976. – Vol. 10. – No. 4. – Pp. 271-285.
5. Volkov, D. E. Porazhaemost' klena ostrolistnogo (Acer platanoides L.) patogennymi gribami v lesnyh soobschestvah Boronezhskoy oblasti / D. E. Volkov, G. M. Mel'kumov, O. M. Sigitova // Sovremennaya mikologiya v Rossii. – 2015. – S. 112.
6. Filippova, N. V. Izuchenie soobschestv gribov verhovyh bolot taezhnoy zony Zapadnoy Sibiri. II. Mikromicety na opade bolotnyh rasteniy // Mikologiya i fitopatologiya. – 2015. – T. 49. – №. 3. – S. 164-172.
7. Bogacheva, A. V. Novye i interesnye nahodki diskomicetov na territorii Habarovskogo kraya // Biota i sreda zapovednyh territoriy. – 2018. – №. 2. – S. 41-53.
8. Infekcionnye bolezni rasteniy semeystva Salicaceae na territorii Hanty-Mansiyskogo Avtonomnogo okruga-Yugry / T. A. Makarova, P. N. Makarov, N. P. Revuckaya, Yu. P. Maksimenko // Vestnik Orenburgskogo gosudarstvennogo universiteta. – 2015. – № 6 (181). – S. 25-32.
9. “MycoBank“; https://www.mycobank.org/ (dostupno: 25.01.2024).
10. “The National Center for Biotechnology Information“; URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (dostupno: 25.01.2024).
11. “Primer-Blast“; URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi (dostupno: 25.01.2024).
12. “BLAST“ ; URL: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (dostupno: 25.01.2024).
13. Konstruirovanie praymerov dlya PCR v programme Primer-BLAST / A. A. Kozyreva, A. M. Zlotina, A. S. Golovkin, O. V. Kalinina, A. A. Kostareva // Translyacionnaya medicina. – 2021. – 8 (3). – S. 37-52. DOI:https://doi.org/10.18705/2311-4495-2021-8-3-37-52.
