Воронеж, Воронежская область, Россия
Воронеж, Воронежская область, Россия
УДК 632 Вредители растений. Болезни растений. Защита растений
УДК 632.4 Грибные болезни растений
В данной работе представлен обзор паразитических грибов рода Rhytisma, встречающихся на территории России: Rhytisma acerinum (Pers.) Fr., Rh. punctatum (Pers.) Fr., субстратом для которых служат различны виды клена, Rh. salicinum (Pers.) Fr., паразитирующего на ивах и Rh. andromedae (Pers.) Fr. – на подбеле. Аскомицеты данного рода являются возбудителями черной (смоляной) пятнистости листьев, наносящей ущерб декоративным качествам растений, и в то же время могут они служить индикаторами экологической обстановки. Виды ритисмы, субстратом для которых служат листья клена, широко распространены в Воронеже и его окрестностях. Целью данной работы являлась разработка на основе имеющихся в базе данных NCBI сиквенсов данных видов специфических праймеров для их молекулярно-генетический идентификации. Для их создания использовалось программное обеспечение Primer-Blast, специфичность полученных последовательностей проверялась in silico посредством модуля BLAST на сайте NCBI. Среди сгенерированных последовательностей праймеров был произведен отбор на соответствие оптимальным параметрам. Использование молекулярно-генетического анализа с данными праймерами может найти применение для ранней диагностики возбудителей, а также в других случаях затруднений морфологического определения видов фитопатогенов.
ритисма, ascomycota, Acer, Salix, Andromeda
Введение
Представители рода Rhytisma – паразитические аскомицеты класса Leotiomycetes, поражающие листья деревьев и трав. По итогам филогенических исследований было предложено рассматривать семейство Rhytismataceae sensu stricto, включая в него восемь родов: типовой род Rhytisma, а также роды Lophodermina, Placuntium, Xyloma, Densorhytisma, Fanglania, Johnstoniella и Shiqia.
Виды ритисмы проявляются крупными черными стромами на живых листьях с одной или несколькими погруженными апотециальными аскоматами, которые прорываются через внешние слои (название таксона происходит от греч. ρυτίς – «морщина»). На данный момент для рассматриваемого рода предложено множество видов и внутривидовых таксонов, однако только меньшая часть из них утверждены, в остальном вопросы их классификации остаются спорными [1].
На территории России встречаются, как минимум, следующие представители данного рода: Rhytisma acerinum (Pers.) Fr. (ритисма кленовая), Rh. punctatum (Pers.) Fr. (ритисма точечная), Rh. salicinum (Pers.) Fr. (ритисма ивовая), Rh. andromedae (Pers.) Fr. Первые два из них паразитируют на различных представителях клена, третий – на иве, четвертый – на травянистых растениях родов Andromeda (подбел), Kalmia, Lyonia, Pieris [2].
Грибы данного рода являются возбудителями черной пятнистости листьев (смоляной пятнистости, англ. «tar spot»). Заражение проявляется в том, что летом на листьях возникают желтые пятна, которые темнеют, ближе к осени становясь черными, с желтым ободком. Пятна, образуемые на листьях Rh. punctatum, содержат характерные структуры из рассеянных черных точек (в то время как у Rh. acerinum они являются сплошь черными, с выпуклыми лабиринтообразными структурами) [3]. Ритисмы, поражающие ивы и подбел, также проявляются обширными выпуклыми черными пятнами с морщинистой поверхностью. Как и некоторые другие паразиты растений, ритисмы могут служить биологическим индикатором условий среды. Атмосферные примеси, в частности сернистый газ, снижают распространенность данного патогена [4].
В результате проведенного мониторинга в Воронежской области Rh. acerinum и Rh. рunctatum обнаружены на листьях A. platanoides L. [5]. Вид Rh. andromedae в ходе исследования верховых болот таежной зоны Западной Сибири был выявлен листьях на Andromeda polifolia L. [6]. Rh. salicinum найдена на листьях Salix sp., на берегу р. Мульпа в Ботчинском заповеднике в Хабаровском крае [7] а также на территории Ханты-Мансийского Автономного округа – Югры [8].
Цель исследования. Данное исследование было выполнено с целью разработки специфических праймеров для определения выше рассмотренных видов рода Rhytisma. Несмотря на то, что зрелые формы ритисмы имеют специфическую морфологию и довольно легко определяются по визуальным признакам, на ранних и промежуточных стадиях развития данные патогены могут иметь неясное проявление на фоне других видов пятнистости. В таком случае уместно применение молекулярно-генетических методов определения возбудителей, в частности с помощью ПЦР со специфическими праймерами. Данный метод может также понадобиться и при исследовании биоматериала, подвергнутого заморозке, высушиванию и другим методам фиксации, затрудняющим морфологическое определение патогенов.
Материалы и методы. Таксономия и систематика грибов сверялась по базе данных «MycoBank» [9]. Для идентификации грибов разрабатывались праймеры на основе ITS1 и ITS2 (Internal transcribed spacer – внутренние транскрибируемые спейсеры), а также 5,8S, 12S, 18S и 28S рРНК. Последовательности ДНК рассматриваемых возбудителей были взяты из базы данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI – The National Center for Biotechnology Information) [10] (Таблица 1).
Таблица 1. Последовательности нуклеотидов представителей Rhytisma
|
Rhytisma acerinum internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence |
gccggccaga ggtccccaaa ccccggaatc cgtgccgtct gagtaccacg caatcgcgaa aaactttcaa caacggatct cttggttccg gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa ttccgtgaat catcgaatct ttgaacgcac attgcgcccc ctggctttcc agggggcatg cctgttcgag cgtcattaca accctcaagc cccggcttgg tcttgggccc gccatccatg gcccgcctca aaagcagtgg cggccccgtc cggtctcaag cgtagtacta ctcgtcgctt gtcgggctcg ggcggcggcc ggccagcaag cccctcacac accaggttga cctcggatca ggtagggata cccgctg |
|
Rhytisma punctatum isolate WA-1 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence |
gccggcccaa agaccccaac ctcttgaatc tgtgccgtct gagtggaacg caaatcgtga aaaactttca acaacggatc tcttggttct ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attccgtgaa tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc tctggatttc ctgggggcat gcctgttcga gcgtcattac aaccctcaag cgcagcttgg tgttgggcct gccggatacg gctcgcctca aagtcagtgg cggcgccgtc cggtctcaag cgtagtacta ctcgtcgctt ggtgggcctg ggcgggcggc cggccagcaa cccccattta tctcggttga cctcgaatca ggtagggata cccgctg |
Окончание табл. 1
|
Rhytisma andromedae voucher Lantz 438 (UPS) 12S small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence; mitochondrial |
tttgggggat gtatagtact cttatgaggc tagttgtgtt ttgaataaaa gtaaatcgtt ataaaataaa cataacacca actacgttgg ataaaattct agatagaata cttattatga ctattttcta tctatatgtc ttgaccaaat tacgtgccag cagtcgcggc aatacgtaga agactagtgt tattcatctt tactaggttt aaagggtacc tagacggtat tattaagcca cctcttcttt gctagaggta aggcaaatat tttactagag tttaatgtaa gaagggagaa tttagggtgt agagatataa ttcgttgata ctctgaagac tggtaatggc gaaagcaccc ttctatgtaa taactgacgt taagggacga aggcttgggg cgcaaccagg attagatacc ctattagtcc atgcagataa ttatgaatgc catagactag atataattta gtttataaat gaaagtgtaa gcattccacc tcaagagtac tgtggcaacg ctggaactga aatcattaga ccgcttctga gaacagtagt gaagcatgtt atataatccg atagccctcg taaaacctta ccacaacttg aatggtgtcc tcttttcttt agcgaagcaa attcgctttt tcttacttgt tgctcagct ctctggtgcc ctaccccttt gctttgctag ggtaagggca aagaagcgca aggccataca aggtctctct agataagtat gccttgcaag gccagagaga gaggggtctt tgcccctcta gaagcaaacc cctcttcatg gggctttgct tctagagcaa aagaagagat attaaattaa agggatgtta caggtgttgc acggttgtct tcagctaatg tcgtgagatt gtggttagtt ccataaaatt agcgtaaacc ccggctttat tttttaatta ttatgataaa gtagttcgtc tgtatattga taaatgataa cagggaaaag ac |
|
Rhytisma salicinum voucher BPI843549 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence |
cattaaagaa ttggtgatgc tctgcgtccc attctcaccc tatgtttatt aaacctcagt tgctttggcc gtcatacagc cggccaaagg accctgaact cttgaattat tgctgtctga gtatatataa caatcgttaa aactttcaac aacggatctc ttggttctgg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgccctc tggtattccg gggggcatgc ctgttcgagc gtcattacaa ccctcaagca acgcttgatg ttaggcctgc cttgattggc gcgccctaaa agaagtggcg gctccgtcca gtctcaagcg tagtaatact cgccacttgt taggcttggg cgagagcttg ccagagaacc cccaatatat atatatatat acacaaggtt gac |
Специфические праймеры разрабатывались на основе данных последовательностей при помощи программного обеспечения Primer-Blast [11]. Специфичность разработанных последовательностей праймеров проверялась in silico посредством модуля BLAST [12] на сайте NCBI.
Результаты и обсуждение. Подобранные праймеры представлены в таблице 2. Среди сгенерированных праймеров были отобраны максимально удовлетворяющие следующим требованиям: отсутствие повторяющихся элементов и палиндромов, оптимальная длина в диапазоне от 16–25 нуклеотидов, соотношение количества AT и GC нуклеотидов около 1:1; низкое значение самокоплементарности полученных праймеров [13].
Таблица 2. Характеристики разработанных праймеров к представителям рода Rhytisma (Tm –температура плавления праймеров, °С; GC % – содержание GC-оснований, %)
|
Праймер |
Последовательность (5'->3') |
Tm |
GC% |
Само-комплемен-тар-ность |
Само-комплементарность 3' |
Длина продукта, п.н. |
|
Rh. acerinum |
||||||
|
Прямой |
CCGTCTGAGTACCACGCAAT |
60.11 |
55.00 |
4.00 |
2.00 |
292 |
|
Обратный |
CCCGACAAGCGACGAGTAG |
60.23 |
63.16 |
3.00 |
2.00 |
|
|
Rh. punctatum |
||||||
|
Прямой |
AATCTGTGCCGTCTGAGTGG |
60.04 |
55.00 |
4.00 |
3.00 |
92 |
|
Обратный |
GCATTTCGCTGCGTTCTTCA |
60.11 |
50.00 |
4.00 |
5.00 |
|
|
Rh. andromedae |
||||||
|
Прямой |
TGACGTTAAGGGACGAAGGC |
60.04 |
55.00 |
4.00 |
2.00 |
508 |
|
Обратный |
GAAGACAACCGTGCAACACC |
59.97 |
55.00 |
4.00 |
1.00 |
|
|
Rh. salicinum |
||||||
|
Прямой |
TACAACCCTCAAGCAACGCT |
59.89 |
50,00 |
3.00 |
3.00 |
120 |
|
Обратный |
TCTCGCCCAAGCCTAACAAG |
60.04 |
55,00 |
3.00 |
3.00 |
|
Заключение
Полученные последовательности праймеров можно использовать для видовой диагностики возбудителей листовых пятнистей растений. В дальнейшем будет проверена эффективность и проведена апробация сконструированных последовательностей на растительном материале с симптомами болезни и без них.
Исследование выполнено в рамках работы по выполнению государственного задания № 5-З23 «Молекулярно-генетическая идентификация фитопатогенов сеянцев (саженцев) основных лесообразующих пород».
1. Phylogeny and taxonomy of Rhytisma-like species worldwide / Q. T. Wang, M. J. Guo, Lv, T., H. S. Zhou, Wang, S. J. Wang, C. L. Hou // Fungal Diversity. – 2023. – Pp. 1-43.
2. Minter, D. W. Rhytisma andromedae. [Descriptions of Fungi and Bacteria] // Descriptions of Fungi and Bacteria. – 1996. – No. 130. – P. 1295
3. Woo, J. Y. The life history and cytology of Rhytisma punctatum on bigleaf maple / J. Y. Woo, A. D. Partridge // Mycologia. – 1969. – Vol. 61. – No. 6. – P. 1085-1095.
4. Bevan, R. J. Rhytisma acerinum as a biological indicator of pollution / R. J. Bevan, G. N. Greenhalgh // Environmental Pollution. – 1976. – Vol. 10. – No. 4. – Pp. 271-285.
5. Волков, Д. Э. Поражаемость клена остролистного (Аcer platanoides L.) патогенными грибами в лесных сообществах Bоронежской области / Д. Э. Волков, Г. М. Мелькумов, О. М. Сигитова // Современная микология в России. – 2015. – С. 112.
6. Филиппова, Н. В. Изучение сообществ грибов верховых болот таежной зоны Западной Сибири. II. Микромицеты на опаде болотных растений // Микология и фитопатология. – 2015. – Т. 49. – №. 3. – С. 164-172.
7. Богачева, А. В. Новые и интересные находки дискомицетов на территории Хабаровского края // Биота и среда заповедных территорий. – 2018. – №. 2. – С. 41-53.
8. Инфекционные болезни растений семейства Salicaceae на территории Ханты-Мансийского Автономного округа-Югры / Т. А. Макарова, П. Н. Макаров, Н. П. Ревуцкая, Ю. П. Максименко // Вестник Оренбургского государственного университета. – 2015. – № 6 (181). – С. 25-32.
9. “MycoBank“; https://www.mycobank.org/ (доступно: 25.01.2024).
10. “The National Center for Biotechnology Information“; URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (доступно: 25.01.2024).
11. “Primer-Blast“; URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi (доступно: 25.01.2024).
12. “BLAST“ ; URL: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (доступно: 25.01.2024).
13. Конструирование праймеров для ПЦР в программе Primer-BLAST / А. А. Козырева, А. М. Злотина, А. С. Головкин, О. В. Калинина, А. А. Костарева // Трансляционная медицина. – 2021. – 8 (3). – С. 37-52. DOI:https://doi.org/10.18705/2311-4495-2021-8-3-37-52.
