Россия
Воронеж, Россия
Россия
Россия
Тема, связанная с использованием аналитических возможностей клинической химии в биохимии спорта, является достаточно актуальной, тем что, благодаря ей произошла оптимизация тренировок, а также исследования помогли улучшить слежку за здоровьем спортсменов, что в наше время очень важно. Данная научная статья посвящена исследованию физических, химических принципов анализа биологических жидкостей человека, которые могут значительно расширить методический арсенал биохимии спорта и спортивной фармакологии. Работа содержит обзор литературы биохимии спорта и клинической биохимии, примеры, а также новые возможности в исследовании белков органов и белков мышечной ткани. Результаты исследования показывают оптимизацию тренировок, диагностики состояния спортсменов и предотвращения проблем со здоровьем.
аналитические возможности, исследование, здоровье
Биохимия спорта и клиническая биохимия представляют собой родственные научно-практические дисциплины, разделы биохимии человека. Обе дисциплины опираются на информацию о состоянии организма человека, получаемую в результате исследований биологических материалов. Поэтому интересы этих дисциплин в сфере аналитики очень близки. Представляется, что спортивная биохимия, биохимической контроль в спорте могут значительно выиграть, используя те аналитические возможности, которыми располагает клиническая биохимия (раздел прикладной биохимии человека, обеспечивающий клиническую медицину лабораторной диагностической информацией).
В качестве примера таких возможностей клинической биохимии, которые могут представить реальный интерес для биохимии спорта, можно указать на некоторые материалы, представленные на международных форумах по клинической химии, состоявшихся в последние годы (V Международный коллоквиум. Перспективы биологии, 1982; Ѵ Европейский конгресс по клинической химии, ВНР, 1983).
Новые возможности в исследовании белков органов, и в частности белков мышечной ткани, предоставляет метод двунаправленного электрофореза, позволяющий разделять и характеризовать тысячи индивидуальных белков [1]. Для идентификации белков необходимо иметь очищенные белки, аналогичные исследуемым; антитела к ним, фиксированные на нитроцеллюлозе; использовать иммуно-преципитацию и метод систематического выделения белков, обладающий высокой разрешающей способностью. Реализация метода требует создания банка поливалентных и моноклональных антител против батареи человеческих белков из различных тканей.
Применение двунаправленного электрофореза для изучения изопротеинов сократительных белков мышц позволяет показать, что соотношение различных видов сократительных белков-миозина, актина, тропонина, тропомиозина индивидуально. Оно связано и с соотношением быстрых и медленных волокон. Так, в частности, в быстрых и медленных волокнах неодинаковое число тяжелых цепей миозина. При некоторых видах патологии мышц происходят существенные изменения сократительных белков. Стимуляция мышц в течение 1, 4, 6 недель существенно меняет картину сократительных белков.
По-видимому, этот метод в будущем может существенно расширить информацию о белковом составе мышц не только при патологии, но и при оценке различных систем тренировки. Комплекс современных ультраструктурных и биохимических методов позволяет дать характеристику отдельного мышечного волокна, а также распределения и уровня активности саркоплазматических и митохондриальных ферментов. Исследование ферментов мышц может включать ряд этапов: 1) определение активности ферментов; 2) двунаправленное картирование белков и иммунологический их анализ с целью поиска неактивных белков; 3) приготовление активной информационной РНК из мышц с иммунологической характеристикой белка, новообразованного с ее помощью. Этот подход углубляет способы оценки состояния мышечной ткани, возможности ее адекватного развития и контроля за процессами гипертрофии соответствующих мышечных групп [4].
Проблема биохимической оценки состояния соединительной ткани одна из актуальных в биохимии спорта. При современных успехах теории и практики спортивной тренировки может быть очень быстро достигнут тренировочный эффект B развитии мышечной массы. Если при этом прочность соединительнотканных образований не увеличивается, то при резком сокращении мышц возможны растяжения, надрывы и разрывы. С этих позиций поиск биохимических путей оценки состояния соединительной ткани и воздействия на нее приобретает первостепенное значение.
H. Greiling [7] было показано, что для каждого типа соединительной ткани (хряща, сухожилия и т. д.) характерно специфическое распределение макромолекул коллагена, протеогликанов, структурных гликопротеинов. От состава различных типов коллагена и протеогликанов зависят биомеханические свойства разновидностей соединительной ткани, а также клеточная структура и метаболизм.
Обращается внимание на возрастные изменения хрящей суставов, отличающиеся от их изменений при воспалительных заболеваниях (остеоартрите, ревматоидном артрите). Определение активности фермента эластазы и комплекса этого фермента и его ингибитора в плазме крови и синовиальной жидкости предлагают для дифференциации воспалительных от невоспалительных поражений суставов. Наряду с этим тестом для оценки состояния обмена коллагена рекомендуется исследование активности коллаген-пептидазы и лизилоксидазы в сыворотке крови, содержания продуктов разрушения коллагена проколлагенпептида и оскипролина в сыворотке.
Для определения активности эластазы гранулоцитов человека в комплексе с ингибитором альфапротеиназы может быть применен метод ферментсвязанного иммуноанализа. Изменения активности этого фермента существенны для скорости разрушения эластиновых волокон, от которых зависит эластичность тканей. Физические упражнения помогают поддерживать высокое содержание эластина в тканях.
Важно в том числе и для биохимии спорта, дальнейшее развитие высокопроизводительной жидкостной хроматографии. Использование гранулированной (340 мкм в диаметре) стандартной фазы и микроколонок (0,5-1,0 мкм в диаметре), микрокювет (5 мкм), высокочувствительных ультрафиолетовых, флюоресцентных, масс-спектрометрических детекторов, насосов высокого давления, микролитровых инъекторов, микропроцессоров создало современную технологию этого вида хроматографии, позволяющую проводить исследования широкого спектра веществ в биожидкостях при высокой точности анализа. Среди веществ, определяемых этим методом и представляющих интерес для спортивной биохимии, следует упомянуть катехоламины, аминокислоты, стероиды. Нижний предел чувствительности для аминокислот 400 фемтомолей (на каждую аминокислоту). По-видимому, метод определения катехоламинов, основанный на высокопроизводительной жидкостной хроматографии с амперометрической, кулометрической или флуорометрической детекцией, в ближайшее время заменит считавшийся наиболее чуствительным и специфичным радиоферментный одноизотопный метод [11].
Новая технология рециклирования ферментов при измерении результатов с помощью биолюминометрии позволяет при использовании микроколичеств биожидкости определять пикограммы веществ, в том числе андрогенов (тестостерона и андростендиона) и эстрогенов. Не уступая в чувствительности радиоиммуноанализу, новый метод более прост и требует меньше времени.
B перспективе этот принцип приемлем для исследования в биожидкостях веществ, используемых в качестве допинга.
Продолжается развитие методов исследования метаболитов, имеющих важное значение для оценки эффекта физических упражнений. Разработан ферментный метод одновременного определения лактата и пирувата в одной и той же депротеинизированной пробе крови на центрифужном биохимическом анализаторе Кобас-Био. Получаемые данные сохраняют линейность до уровня, превышающего верхний предел референтных величин в 8 раз при определении пирувата и в 6 раз лактата. Коэффициент вариации внутри серии 1,7-1,8%; между сериями 3,5-3,9%. Метод относительно прост и удобен для экстренного и рутинного применения [5]. Создание электрода для определения лактата с помощью иммобилизованной лактат-оксидазы открывает возможности автоматизации этого анализа, весьма часто применяемого в биохимии спорта.
Привлекает внимание возможность использования нетравматических методов для обследования спортсменов. С этих позиций особенно ценен метод ядерно-магнитного резонанса. Ткань, помещенная в статическое магнитное поле и облученная электромагнитными импульсами, реагирует импульсами этой же частоты, зависящими от плотности протонов. Среди атомов, активных в отношении ядерномагнитного резонанса, используется и ³¹Р [7]. Спектр изотопа фосфора позволяет получить представление о распределении этого элемента между различными формами органических и неорганических фосфатов. Эта информация важна для наблюдения за динамикой энергетически важных веществ in vivo, т. е. в работающей мышце. В частности, можно уловить снижение содержания креатинфосфата, аденозинтрифосфата при нарушении питания мышц.
Результаты недавних исследований ряда спортивных биохимиков [3,6] подтверждают практическую ценность этого метода для изучения обмена соединений фосфата в мышцах рук и ног при выполнении тестовой нагрузки.
Большие возможности для быстрого и достаточно точного биохимического исследования крови человека открывает дальнейшее развитие методов и средств, основанных на реакциях на твердой фазе, в частности диагностических полосок.
Новый вариант этих реакций - ARIS (система иммуноанализа с реактивацией апофермента) позволяет, основываясь на реактивации апофермента глюкозооксидазы с включением дополнительной реакции с пероксидазой, обеспечить определение лекарственного вещества теофиллина, результаты которого хорошо коррелируют (r=0,983) с методом высокопроизводительной жидкостной хроматографии. Дальнейшее развитие этого принципа может привести к совершенствованию методов экспресс-определения различных лекарственных средств, в том числе и применяемых в качестве допинга.
Использование пленки из стекловолокна в качестве верхнего разделительного слоя диагностической полоски для отделения клеток крови от плазмы позволит исключить необходимость центрифугирования крови перед количественным исследованием компонентов химического состава крови [10]. Измерительными инструментами для таких диагностических полосок служат отражательные фотометры, в частности «Сералайзер» и «Рефлотрон», позволяющие измерять окраску полоски с помощью интегрирующей сферы при различных длинах волн для анализа разных веществ (глюкозы, гемоглобина, ферментов). Разработка этой технологии для круга компонентов, представляющих интерес B биохимии спорта, может оказать революционизирующее влияние на осуществление биохимического контроля в спорте, упростить его проведение и унифицировать его результаты вне зависимости от условий проведения (тренировка, соревнование и т. п.).
Для спортивной фармакологии перспективно современное развитие лабораторных методов определения лекарств в биожидкостях с помощью гомогенного иммуноферментного анализа (EMIT), для которого разработаны готовые аналитические формы и автоматические устройства. Правда, эта технология в настоящее время ориентирована преимущественно на те лекарства, которые имеют токсикологическое значение, однако принципиально возможна разработка соответствующих готовых иммуноферментных препаратов, рассчитанных на определение веществ, интересующих спортивных фармакологов [2].
Наряду с классическим гетерогенным (ELYSA) и гомогенным (EMIT) иммуноферментным анализом намечается развитие новых вариантов гомогенного неизотопного иммуноанализа для выявления лекарств в крови. В их числе флюоресцентный поляризационный иммуноанализ, субстрат-меченый флюоресцентный иммуноанализ, иммуноанализ с нефелометрическим торможением. В будущем значение этих разновидностей неизотопного иммуноанализа для рутинных исследований концентрации лекарств в крови [8] ввиду быстроты и простоты их выполнения будет все возрастать. Получило промышленную основу производство моноклональных антител, что очень важно для широкого выпуска готовых аналитических форм, применяемых в иммуноферментном и других вариантах неизотопного иммуноанализа.
Показана возможность применения метода иммуноферментного анализа для исследования природных и синтетических стероидов в плазме и слюне человека [9]. Специфичность и чувствительность метода можно повысить, используя иммуноадсорбцию на твердой фазе. Связывание антисыворотки с твердой фазой может быть ускорено за счет применения твердой фазы с магнитными частицами и простого магнитного устройства. Большая пропускная способность методов в сочетании с чувствительностью порядка 10 пикограмм на пробирку и менее делает его пригодным для клинических и фармако-клинических исследований проб плазмы и слюны. Слюна, содержащая свободные биологически активные фракции природных и синтетических стероидов, является биологической жидкостью, которая может быть получена нетравматическим путем (чтобы собрать 3 мл слюны, достаточно 10 мин). Метод представляется перспективным для биохимии спорта в качестве средства экспресс-определения природных гормонов, регулирующих реакцию организма в ответ на физическое напряжение, и синтетических стероидов.
Таким образом, современная клиническая аналитика, продолжающая бурно развиваться за счет освоения ряда новых физических, химических и биологических принципов анализа, располагает широким кругом эффективных методов исследования биологических жидкостей человека, которые могут значительно обогатить методический арсенал биохимии спорта и спортивной фармакологии.
1. Anderson N. G. In: Biologie prospective, v. 1, Paris, 1983, 69-73.
2. Be gaud B., Pe- re J. C. et al. In: Biologic prospective, v. 2, 1191-1196.-3. Chance B. et al. In: Biochemistry of exercise. Intern. Series on Sport Sciences, v. 13, Champaign, 1983, 895-908.
3. Dreyfus J. C. et al. In: Abstract volume 5th European Congress of Clinical Chemistry, Budapest, 1983.
4. Fr a sca- tore S. et al. In: Abstract volume 5th European Congress of Clinical Chemistry, Budapest, 1983.
5. Gollnick P. D. In: Biochemistry of Exercise, Champaign, 1983, 909-921.
6. Greiling H. In: Abstract volume 5th European Congress of Clinical Chemistry, Budapest, 1983.
7. Oclle- rich M. et. al. In: Biologie prospective, v. 2, Paris, 1983, 1169-1173.
8. Riad - Fahmy D. et al., ibidem, v. 1, 291-296.
9. Werner W. et al. Ibidem, v. 1, 525-528.
10. Wisser H., Knoll E. In: Abstract volume 5th European Congress of Clinical Chemistry, Budapest, 1983.
