Россия
Россия
Россия
Засоление почвы является одной из основных проблем сельского хозяйства, оно оказывает значительное воздействие на рост и развитие сельскохозяйственных культур. Повышенное содержание солей в почве приводит к увеличению осмотического давления, что затрудняет поступление воды и питательных веществ в растение. Это приводит к изменению метаболизма растений, в частности, нарушается функционирование цикла Кребса, который является основным источником энергии для роста растений. Кроме того, засоление почвы влияет на функционирование ГАМК-шунта, который играет важную роль в регуляции стрессовых реакций у растений. Важную роль в адаптации растений к абиотическим стрессам играет фермент γ –гидроксибутиратдегидрогеназа. К сожалению, на данный момент функционирование данного энзима в растительной клетке малоизучено. В связи с этим нами было изучено влияние солевого стресса на ферментативную активность ГБДГ в листьях проростков кукурузы. Было показано воздействие засоления индуцирует активность ГБДГ в листьях кукурузы начиная с первого часа инкубации в стрессовой среде.
γ-гидроксибутиратдегидрогеназа, солевой стресс, кукуруза, ГАМК-шунт, ферментативная активность
Введение
Одной из самых распространенных проблем, влияющих на мировое сельское хозяйство, является засоление. Высокие уровни солей в почве могут привести к тому, что растения не смогут нормально поглощать воду и питательные вещества, что приведет к замедлению их роста и развития, нарушению биохимических процессов в клетке, которые могут вызвать гибель растения.
Кукуруза является культурой, которая требует большого количества воды, поэтому засоленные почвы могут серьезно угрожать её урожайности. При этом, засоление может повлиять на содержание минеральных элементов в растениях, что отразится на их качестве и питательной ценности.
В условиях засоления происходит сбой в работе цикла Кребса – основного компонента дыхательного метаболизма растений [Ошибка! Источник ссылки не найден.]. При этом в клетке начинает функционировать компенсаторный механизм – шунт γ–аминомасляной кислоты (ГАМК-шунт).
ГАМК – широко распространённая среди всех живых организмов небелковая аминокислота. ГАМК играет важную роль в жизнедеятельности высших растений: учувствует в регуляции фотосинтеза, роста, развития, а также ответа на стрессовые воздействия.
Метаболизм ГАМК осуществляется по особому короткому пути известному как ГАМК-шунт, который обходит две реакции цикла Кребса.
Янтарная полуальдегиддегидрогеназа (ССАДГ, 1.2.2.16) является ключевым ферментом ГАМК–шунта. Однако в условиях продолжительного дефицита кислорода данный энзим перестает функционировать, что приводит к возникновению ряда метаболических реакций.
Для детоксикации янтарного полуальдегида и обеспечения функционирования растительной клетки существует альтернативный путь, включающий фермент γ –гидроксибутиратдегидрогеназу − энзим класса оксидоредуктаз (ГБДГ, КФ 1.1.1.61), катализирующий реакцию превращения γ−гидроксибутирата до сукцинилового полуальдегида, при этом 
восстанавливается до НАДН.
У растений гамма–гидроксибутиратдегидрогеназа играет ключевую роль в преобразовании янтарного полуальдегида, полученного из ГАМК, до ГОМК в условиях абиотического стресса.
Целью исследования было изучить влияние засоления на ферментативную активность γ-гидроксибутиратдегидрогеназы в листьях проростков кукурузы in vivo.
Материал и методы исследования. Основными объектами исследования были 14-дневные проростки кукурузы сорта Воронежская-76 (Zea mays L.), выращенные гидропонным способом в климатической камере "LabTech" (Корея) при десятичасовом световом дне. Интенсивность освещения составляла 25 Вт/м2, температура окружающей среды − 25°C.
В ходе эксперимента у растений вызывали солевой стресс путем инкубации в солевом растворе в течение 24 часов. Раствор для инкубации содержал 150 мМ хлорида натрия (NaCl) и был заменен водой на тот же период времени в контрольной группе. Корневая система у растений в контрольной и экспериментальной группах была удалена.
Исследование включало отбор проб до начала инкубации (0) и через 1, 3, 6, 12 и 24 часа после начала эксперимента.
Активность γ-гидроксибутиратдегидрогеназы в исследуемых образцах определяли по скорости образования НАДН при длине волны 340нм с помощью спектрофотометра Evolution 260 Bio (Thermo Fisher Scientific, США) при 25°C. Среда спектрофотометрирования представляла собой раствор, содержащий 16 мМ гидроксибутирата натрия (Sigma Aldrich, США), 1 мМ НАД+, 100 мМ Tris–HCl буфер (рН 9.0). Реакцию инициировали добавлением ферментного препарата. Контролем служила среда спектрофотометрирования без добавления препарата фермента.
За единицу активности фермента принимали количество фермента, преобразующего 1 мкмоль субстрата за 1 мин при оптимальном pH и температуре 25 °C.
Эксперимент проводили в 3-4-кратных биологических повторностях, аналитическое определение каждого образца проводили также три раза. Для статистического анализа полученных данных использовали программу STATISTICA 12.0.
Количественные параметры оценивали на соответствие нормальному распределению с использованием критерия Шапиро-Уилка. Графически результаты выражали как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM). Для анализа различий использовали критерий Стьюдента и однофакторный дисперсионный анализ. Различия, представленные в статье, являются статистически значимыми (p≤0,05).
Результаты исследования и их обсуждение. В результате данного эксперимента было обнаружено, что ферментативная активность ГБДГ увеличивалась при инкубации проростков кукурузы в растворе хлорида натрия (рис. 1).
Результаты показали, что активность фермента увеличилась в три раза в первый час действия солевого стресса и оставалась выше контрольного значения, хотя в последующие часы она снижалась. Начиная с 12-го часа засоления активность ГБДГ возрастала вторично и достигла максимума на 24-м часу эксперимента. При этом показатель общей активности исследуемых ферментов был в 10 раз выше контрольного значения.
Рисунок 1 – Динамика общей ферментативной активности γ–гидроксибутиратдегидрогеназы в листьях кукурузы в условиях действия солевого стресса. NaCl – опытная группа,
H2O – контрольная группа. Различия между значениями контрольной и опытной группы статистически достоверны (p≤0.05)
Заключение
Таким образом, в результате эксперимента было показано, что в листьях кукурузы в условиях засоления наблюдается увеличение активности гамма-гидроксибутиратдегидрогеназы с первого часа инкубации проростков в растворе NaCl. Максимальная активность фермента наблюдалась через 24 часа инкубации и составляла 5,6 Е/г с.м. Такой механизм ответной реакции на солевой стресс, вероятно, связан с переключением потока янтарного полуальдегида для поддержания жизнедеятельности и адаптации к стрессору.
1. Анохина Г. Б. и др. Влияние солевого стресса на функционирование 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса кукурузы (Zea mays L.) // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. – 2019. – №. 3. – С. 26-33.
2. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. – М.: Высш. шк., 1990. – 351с.
3. Zar J. H. Biostatistical analysis. – Pearson Education India, 1999.
4. Breitkreuz K. E. et al. A novel γ-hydroxybutyrate dehydrogenase: identification and expression of an Arabidopsis cDNA and potential role under oxygen deficiency //Journal of Biological Chemistry. – 2003. – Т. 278. – №. 42. – С. 41552-41556.
5. Fait A., Yellin A., Fromm H. GABA and GHB neurotransmitters in plants and animals // Communication in plants: Neuronal aspects of plant life. – 2006. – С. 171-185
6. Ji J. et al. Roles of γ-aminobutyric acid on salinity-responsive genes at transcriptomic level in poplar: Involving in abscisic acid and ethylene-signalling pathways //Planta. – 2018. – Т. 248. – С. 675-690.
7. Taxon E. S., Halbers L. P., Parsons S. M. Kinetics aspects of Gamma-hydroxybutyrate dehydrogenase //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. – 2020. – Т. 1868. – №. 5. – С. 140376.
